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AAV病毒包裝

日期：2016-10-21 10:34:21

(一) AAV-293細胞的凍存
隨著傳代的次數增加，AAV-293 細胞會出現生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現象的出現，我們需要在開始就對細胞進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細胞對數生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。
1、去掉細胞培養(yǎng)上清液，加入PBS 洗去殘留的培養(yǎng)基;
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。
3、細胞計數，將細胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 預熱的 10% DMEM，用 10mL 移液管進行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50ul 混勻后的細胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即為 10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細胞于計數板中計數。計數板上共 4 大格，每大格 16 小格。計數時，4 大格均計數，總數除以 4(得每大格細胞數)，再乘以 10(10 倍稀釋)，即為實際 n 萬/mL 細胞濃度。
4、細胞離心，1000 rpm/min，5min。去掉上清。
5、根據細胞計數結果加入細胞凍存液(70%完全培養(yǎng)基 20%FBS 10%DMSO)重懸細胞，密度為3 x 106 個/ml。
6、分裝進細胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80℃超低溫冰箱。
7、第二天將細胞放于液氮罐中長久保存，并作記錄。保存過程中，要不時復蘇細胞檢測細胞存活率，觀察細胞狀態(tài)等。
(二)AAV-293 細胞的傳代
當細胞生長到匯合率達到 80%~90%時需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。
1、消化細胞，方法同細胞凍存。
2、細胞離心結束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。
3、根據具體情況，將細胞分到10cm 培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿補足到10ml 培養(yǎng)基。
(三)AAV-293 細胞的復蘇
當細胞傳代次數過多，細胞狀態(tài)變差時，或者細胞出現污染事故時，需要丟棄并對最初凍存的細胞進行復蘇。
1、設置溫度為37~42℃的水浴。
2、查看細胞庫記錄，根據記錄從液氮罐中取出凍存的細胞(需戴上棉手套，防止被凍傷)，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，盡量在1~2min 內使細胞溶液完全
溶解。
3、將細胞溶液轉移到15ml 離心管中，并在其中加上1ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000 rpm/min，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉入6 cm 培養(yǎng)皿。
5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37℃、5% CO2 和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6、第二天觀察細胞存活率。給細胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細胞生長情況。
(四)AAV包裝和濃縮
1. 質粒擴增
構建好的AAV載體、包裝質粒和輔助質粒需經過大量抽提，濃度大于1ug/ul，A260/280 在1.7-1.8 間方可用以包毒。推薦使用Qiagen 大抽試劑盒進行質粒的大量去內毒素抽提。
2. 傳AAV-293細胞
將培養(yǎng)AAV-293 細胞T75 瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37 度培養(yǎng)箱中3-5min，取出，搖晃可發(fā)現細胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3mL 37 度水浴中預熱的10% DMEM，移液槍用10mL 移液管進行吹打，較大力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對準培口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細胞。之后，將所有細胞吸出，置于15mL 離心管中，取50ul 混勻后的細胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10% DMEM，即為10 倍稀釋，混勻，取10ul 細胞于計數板中計數。計數板上共4 大格，每大格16 小格。計數時，4 大格均計數，總數除以4(得每大格細胞數)，再乘以10(10 倍稀釋)，即為實際n 萬/mL 細胞濃度。傳代當天記為第一天，若第二天進行轉染，鋪900-1000 萬/T75;若第三天轉染，鋪350-400 萬/T75。每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培養(yǎng)基。轉染當天觀察細胞密度，80-90%滿即可進行轉染。轉染前無需換培養(yǎng)基。
3. 做脂轉complex

試劑名稱	試劑數量
載體質粒	5ul(1.0ug/ul)
包裝質粒	5ul(1.0ug/ul)
輔助質粒	5ul(1.0ug/ul)

注：LipofiterTM轉染試劑為漢恒生物產品，使用說明參考LipofiterTM說明書。
4. AAV 病毒收毒：
病毒顆粒同時存在于包裝細胞和培養(yǎng)上清中?？梢詫⒓毎团囵B(yǎng)上清都收集下來以獲得最好的收率。
1) 準備一個干冰乙醇浴(將乙醇傾入裝有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37?C 水浴;
2) 將產毒的細胞連同培養(yǎng)基一同收集到一個15ml 的離心管中。收集細胞時，將培養(yǎng)盤傾斜一定角度將細胞刮到培養(yǎng)基中;
3) 1000 rpm/min，離心3 分鐘，分離細胞和上清，將上清另外存放，細胞用1ml PBS 重懸;
4) 將細胞懸浮液在干冰乙醇浴和37?C 水浴中反復轉移，凍融四次。每次融解后稍加震蕩。注意：每次凝固和解凍大概需要十分鐘的時間。
5. AAV 病毒濃縮：
1) 10,000 g 離心去除細胞碎片，將離心上清轉移到一個新離心管中。
2) 將兩次收集的上清混合在一起，用 0.45um 濾器過濾除雜質
3) 加入 1/2 體積的 1M NaCl，10% PEG8000 溶液，混合均勻，4度過夜
4) 12,000 rpm 離心 2h，棄上清，病毒沉淀用適量的 PBS 溶液溶解，待完全溶解后用 0.22um 濾器過濾除菌。
5) 加入 Benzonase 核酸酶消化去除殘留的質粒DNA(終濃度為50 U/ml)。合上管蓋，顛倒幾次以充分混合。在37 ?C 孵育30 分鐘;
6) 用 0.45 μm 過濾頭過濾，取濾出液，即為濃縮的AAV病毒。
6. AAV的純化
1) 向病毒濃縮液中添加固體 CsCl 直到密度為1.41 g/ml(折射率為1.372);
2) 將樣品加入到超速離心管中，用預先配好的 1.41 g/ml CsCl 溶液將離心管剩余空間填滿;
3) 在 175,000 g 下離心24 小時，以形成密度梯度。按順序分步收集不同密度的樣品，取樣進行滴度測定。收集富集有AAV 顆粒的組分;
4) 重復上述過程一次。
5)將病毒裝入100 kDa的透析袋，4度透析脫鹽過夜。此即為純化的AAV病毒
AAV病毒包裝滴度測定(采用 Q-PCR 法)
1)取 20ul 濃縮病毒液，加入 1ul RNAse-free DNAse，混勻，37℃水浴反應30min。
2)4℃，12 000 rpm/min，離心 10 min，取 10ul 上清到另一個無菌的 1.5ml EP 管中。
3)加入 90ul Dilution Buffer(1 mM Tris-HCl, pH 8.0，0.1 mM EDTA，150 mM NaCl)，混勻，37℃金屬浴反應 30min。
4)自然冷卻至室溫，加入 1ul 蛋白酶 K，65℃水浴反應 1h。
5)100℃金屬浴反應 10min，自然冷卻至室溫。
6)進行 Q-PCR 檢測滴度。
AAV病毒的儲存、稀釋
1. 病毒的儲存：
收到病毒液后在很短時間內即使用腺相關病毒進行實驗，可以將病毒暫時放置于 4℃保存;如需長期保存請放置于-80℃(病毒置于凍存管，并使用封口膜封口)。
1)病毒可以存放于-80℃ 6 個月以上;但如果病毒儲存時間超過 6個月，建議在使用前需要重新測定病毒滴度。
2)反復凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%;因此在病毒使用過程中應盡量避免反復凍融，為避免反復凍融，建議收到病毒后按照每次的使用量進行分裝。
2. 病毒的稀釋：
如果需要稀釋病毒，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用 PBS 緩沖液或培養(yǎng)目的細胞無血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)。混勻分裝后 4℃保存(請盡量在三天內用完) 分裝后使用。
AAV使用安全注意事項
1.病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風機。
2.病毒操作時請穿實驗服，帶口罩和手套。
3.操作病毒時特別小心不要產生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用 70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液等請用 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡過夜后棄去。
4.用顯微鏡觀察細胞感染情況時應遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用 70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實驗臺。
5.如需要離心，應使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養(yǎng)室內的離心機。
6.脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。

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